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发布时间：2024-10-28
基因突变体库的另一大类构建方法是体内突变法，即在胞内诱导特定基因的突变，无需进行基因克隆与转化，很大程度上缩短了定向进化的实验周期。例如早期开发的基于单链DNA重组的多元自动化基因组工程技术(multiplex automated genome engineering, MAGE)，是针对大肠杆菌基因组上特定基因进行体内诱变的重要策略。近年来，CRISPR-Cas介导的重组技术实现了在原核与真核细胞中对目的基因进行高效的片段插入、删除和替换，大大提高了原核与真核细胞中重组的效率，因此也发展了一批高效的胞内蛋白质定向进化工具。例如将CRISPR-Cas系统和MAGE整合后，基因重组效率由3%提高到98%，插入/替换效率提高至70%;将CRISPR-Cas9与epPCR偶联(CasPER)可以向酵母基因组中任意基因的600 bp内引入随机突变。
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